液相色谱质谱联用法定量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法与流程

本发明涉及一种检测儿茶酚胺及其代谢物的方法，更具体地是指液相色谱质谱联用法定量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法。

背景技术：

：嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,pcc)和副神经节瘤(paraganglioma,pgl)是分别起源于肾上腺髓质或肾上腺外交感神经链的肿瘤，主要合成和分泌大量儿茶酚胺(ca)，如去甲肾上腺素(ne)、肾上腺素(e)及多巴胺(da)，引起患者血压升高等一系列临床症候群，并造成心、脑、肾等严重并发症。pcc占80％-85％，pgl占15％-20％，二者合称为ppgl。ppgl是一种少见的内分泌疾病，在普通高血压门诊中ppgl的患病率为0.2％-0.6％。ppgl的主要临床表现为高ca分泌所致的高血压及其并发症，由于肿瘤持续性或阵发性分泌释放不同比例的e和ne，故患者的临床表现不同。激素及代谢产物的测定是ppgl定性诊断的主要方法，包括测定血和尿ne、e、da及其中间代谢产物甲氧基肾上腺素(mn)、甲氧基去甲肾上腺素(nmn)和终末代谢产物香草扁桃酸(vma)浓度。mn及nmn(合称mns)是e和ne的中间代谢产物，它们仅在肾上腺髓质和ppgl瘤体内代谢生成并且以高浓度水平持续存在，故是ppgl的特异性标记物。因肿瘤分泌释放ne和e可为阵发性并且可被多种酶水解为其代谢产物，故当ne和e的测定水平为正常时，而其mns水平可升高，故检测mns能明显提高ppgl的诊断敏感性及降低假阴性率。

专家共识推荐诊断ppgl的首选生化检验为测定血游离mns或尿mns浓度，其次可检测血或尿ne、e、da浓度以帮助进行诊断。然而使用mns诊断嗜铬细胞瘤在检测方法上存在问题，目前大多数出版的文献检测血浆mns使用的是hplc结合电化学检测技术，部分实验室仍在使用放免法。这些检测方法十分耗时、繁琐并且其特异性、敏感性均有不足。mns在体内含量低，同构干扰物多，因此在临床诊断嗜铬细胞瘤就需要特异性更佳的方法。目前知识产权局网站上公开的“人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法”，其包括固相萃取处理血浆样本和电喷雾阳离子多反应监测模式(mrm)可同时检测2种儿茶酚胺代谢物，该方法具有以下缺陷：1)样本前处理所需血浆用量大；3)洗脱体积偏大，前处理时间延长；4)上机采用较大的进样体积来满足线性低浓度样本的检测；5)上机检测流速偏大，试剂成本较高；6)采用甲酸-醋酸铵缓冲盐体系，分离度偏差，难以保证重现性；7)线性范围偏窄，不能完全应用于临床高浓度样本的定量检测；8)灵敏度偏低。技术实现要素：本发明的目的是公开一种液相色谱质谱联用法定量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法，可定量检测人血浆样本中6种儿茶酚胺类激素，检测结果可以辅助临床医生用于成年人体内儿茶酚胺类激素含量异常相关疾病的诊断。

为实现上述目的，本发明公开的液相色谱质谱联用法定量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法，其主要步骤为：1)样本预处理；2)经预处理的样本溶液进行固相萃取，提取血浆中儿茶酚胺及其代谢物；3)通过液相色谱质谱联用法特异性检测每种分析物及其内标，将分析物与内标信号的比率与校准曲线的比率进行比较以确定分析物浓度。所述的方法中，质谱分析采用多反应监测扫描，多反应监测扫描是将第一级质谱设定为用于筛选特定的母离子，在第二级质谱中指定所需的产物；分析物及其内标特异多反应监测扫描离子对在色谱分离过程中被连续监测，仅有在特定mrm在正确分析保留时间被记录时信号才能被定量。所述的方法中，样本预处理的过程为：a)血浆样本的离心取edta抗凝的待检测全血离心得到血浆，将上述血浆于-80℃冷冻下保存至分析前备用；b)移取含有乙酸铵水溶液配制的内标工作液加入血浆中，涡旋混匀制成血浆混合溶液。所述的方法中，血浆混合溶液经过液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测后分别得出甲氧基肾上腺素(mn)、甲氧基去甲肾上腺素(nmn)、3-甲氧基酪胺(3-mt)、肾上腺素(e)、去甲肾上腺素(ne)和多巴胺(da)的色谱图及其对应内标液中的甲氧基肾上腺素-d3、甲氧基去甲肾上腺素-d3、3-甲氧基酪胺-d4、肾上腺素-d6、去甲肾上腺素-d6和多巴胺-d4的色谱图。

所述的方法中，提取血浆中儿茶酚胺及其代谢物的过程为：a)依次采用含有甲酸的乙腈溶液、乙酸铵水溶液对固相萃取板进行活化。b)移取预处理的血浆样本溶液至固相萃取板，依次用乙酸铵水溶液、乙腈或甲醇或异丙醇进行清洗，加入含有甲酸的乙腈溶液洗脱，将洗脱液于氮气室温下吹干，用流动相a进行复溶，得到待测样品。所述的方法中，通过液相色谱质谱联用法特异性检测每种分析物及其内标，将分析物与内标信号的比率与校准曲线的比率进行比较以确定分析物浓度的过程为：采用梯度洗脱反相色谱法对分析物进行分离，色谱柱为pfp柱，流动相a为水溶液，流动相b为乙腈溶液，二者均含有0.1％-1％有机酸，其中有机酸为甲酸、乙酸中的一种或者一种以上，a相:b相体积比为95％-20％:5％-80％，流速为0.2-1ml/min；质谱检测采用电喷雾离子源(esi)和多反应监测模式(mrm)，各分析物检测离子对分别为：mn,180.1>148.3；mn-d3,183.1>151.1；nmn,166.1>134.1；nmn-d3,169.1>137.1；3-mt,151.1>91.1；3-mt-d4,155.1>95.1；e,166.1>135.1；e-d6,172.1>112.1；ne,152.1>107.1；ne-d6,158.1>111.3；da,137.1>91.1；da-d4,141.1>95.1。

与现有的质谱检测方法比较，本发明具有以下几个显著的优点：(1)使用稳定同位素标记物作为内标，检测结果更准确，重现性更好：本方法采用与分析物结构一致的同位素标记物内标，可有效校正实际临床样本的基质效应的影响(如高脂质，肝肾功能受损患者的基质和溶血)，确保检测结果的准确性。(2)本方法采用母离子和子离子筛选的多反应监测模式(mrm)进行检测，通过对特征母离子和子离子的筛选，从而有效降低生物样本中复杂组分的干扰，提高方法的专属性和灵敏度。(3)本方法检测单个样本的仪器分析时间仅为4分钟，较传统高效液相色谱法大大缩短。前处理采用96孔板，大大提高操作效率；此外结合使用液质联用仪的自动进样系统，可实现自动化和高通量检测。(4)样本前处理过程简单，采用弱阳离子交换固相萃取方法来处理样本，对儿茶酚胺类物质具有较高的回收率，同时有效降低样本中复杂基质的干扰，获得更好的灵敏度。(5)前处理不需要复杂的衍生化操作。(6)色谱柱采用五氟苯基柱，流动相采用常规反相乙腈-水-甲酸体系，配制简单，无需缓冲盐，分析物分离度好，响应高，重现性好。附图说明图1分别是分析物甲氧基肾上腺素(mn)、甲氧基肾上腺素(mn)、肾上腺素(e)、去甲肾上腺素(ne)、3-甲氧基酪胺(3-mt)和多巴胺(da)色谱图；图2a是甲氧基肾上腺素(mn)的线性回归分析图；图2b是甲氧基去甲肾上腺素(nmn)的线性回归分析图；图2c是3-甲氧基酪胺(3-mt)的线性回归分析图；图2d是肾上腺素(e)的线性回归分析图；图2e是去甲肾上腺素(ne)的线性回归分析图；图2f是多巴胺(da)的线性回归分析图。

具体实施方式本发明公开了一种检测血浆mns和ca的液相色谱-串联质谱方法，可定量检测人血浆样本中6种儿茶酚胺类激素，检测结果可以辅助临床医生用于成年人体内儿茶酚胺类激素含量异常相关疾病的诊断。本发明的主要原理是使用固相萃取法(spe)分离人血浆中儿茶酚胺和甲氧基肾上腺素类物质，可同时完成样品富集与净化，大大提高检测灵敏度。稳定同位素内标准品溶液在提取过程中被加入，进行与分析物相同的处理，从而使样品制备和仪器可变性标准化。通过lc-ms/ms法特异性检测每种分析物及其内标。将分析物与内标信号的比率与校准曲线的比率进行比较以确定分析物浓度。质谱分析采用了多反应监测扫描(mrm)，多反应监测扫描是将第一级质谱设定为用于筛选特定的母离子，在第二级质谱中指定所需的产物。分析物及其内标特异mrm离子对在色谱分离过程中被连续监测。仅有在特定mrm在正确分析保留时间被记录时信号才能被定量。因此，本试剂盒的定量是高度特异性的。每个分析物的次级mrm传递能被监测，这样提供一种额外高的分析特异性水平。本发明解决了儿茶酚胺及其代谢物常规采用hilic体系进行色谱分离，存在分析物峰型偏宽、信号偏低、重现性差等问题，采用pfp柱反相体系，更好地改善分析物峰型、提高响应信号，并且流动相体系避免了甲酸铵等缓冲盐体系，减少质谱污染，采用乙腈-水-甲酸体系，配制简单。

本发明解决了儿茶酚胺及其代谢物在同一个方法一次检测的技术问题，分离度好，各分析物检测信号高，受基质干扰较小。本发明儿茶酚胺及其代谢物前处理无须蛋白沉淀和衍生化来提高分析物灵敏度，简化了样本前处理操作步骤，缩短了样本处理时间，效率更高，灵敏度更好。本发明采用固相萃取儿茶酚胺及其代谢物，所需血浆样本量少，大大减少了血浆基质内源性干扰物质，减少色谱柱和仪器污染。本发明要解决的技术问题是：目前液相色谱质谱联用法检测儿茶酚胺及其代谢物一般采用血浆样本衍生化等复杂的前处理操作，并采用hilic与缓冲盐体系进行色谱分离，存在分析物峰型偏宽、信号偏低，重现性差等问题，而且缓冲液体系对仪器维护难度大。针对上述技术问题，本发明公开了一种血浆中儿茶酚胺及其代谢物准确定量的液相色谱串联质谱联用方法，前处理操作、流动相配制过程简单易行，准确度、精密度、灵敏度高，可以广泛适用。本发明为解决上述技术问题所采用的方案是：(一)标准溶液的配制(a)分析物工作液的配制：精密称量标准品置于容量瓶中，用含有0.05％-2％抗坏血酸10％-80％甲醇水溶液进行溶解并定容至刻度，配制得到浓度为0.1-10mg/ml的储备液。用含有0.05％-2％抗坏血酸10％-80％甲醇水溶液将储备液进行稀释，得到浓度为10-100μg/ml的中间液1。

用含有0.05％-1％抗坏血酸水溶液将中间液1进行稀释，得到浓度为1-200ng/ml浓度范围内的工作液1，并在-80℃条件下保存。用含有0.05％-2％抗坏血酸水溶液将工作液1进行梯度稀释，得到至少7种不同浓度水平的工作液2-8(见表1)。(b)分析物同位素内标工作液的配制准确移取浓度为0.1-1mg/ml的同位素内标储备液，用含有0.05％-1％抗坏血酸10％-80％甲醇水溶液将储备液稀释得到浓度为0.01-10μg/ml的内标中间液1。继续用含有0.05％-1％抗坏血酸水溶液将内标中间液1稀释得到浓度为1-100ng/ml的内标中间液2。用含有20-100mmol/l乙酸铵水溶液将内标中间液2进行稀释，配制得到浓度为0.1-10ng/ml浓度范围内的工作液，并在-80℃条件下保存。(c)用校准溶液标定，得到标准曲线方程准确移取上述不同浓度的5-40μl分析物工作液，分别与50-400μl替代基质混合，并置于1.5ml离心管中混合制成不同浓度校准溶液，涡旋混匀1min，具体浓度见表1。此处的替代基质经固相萃取后用超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述复溶液进行检测，分别得出上述不同校准溶液中的甲氧基肾上腺素(mn)、甲氧基去甲肾上腺素(nmn)、3-甲氧基酪胺(3-mt)、肾上腺素(e)、去甲肾上腺素(ne)和多巴胺(da)的色谱图及其对应内标液中的甲氧基肾上腺素-d3、3-甲氧基酪胺-d4、甲氧基去甲肾上腺素-d3、肾上腺素-d6、去甲肾上腺素-d6和多巴胺-d4的色谱图，分析物峰面积与其对应内标液的峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以分析物浓度及其对应内标液的浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝ax+b，并且得出权重系数a。

(二)检测血液的离心取edta抗凝的待检测全血至少1ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血浆，将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样品处理(d)用移液枪移取步骤(b)的内标液20-300μl于1.5ml的离心管中，然后加入步骤(二)的50-400ul血浆于上述离心管中，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1.5min；分别用100-300ul含有0.1％-10％甲酸乙腈溶液和5-100mmol/l乙酸铵水溶液对spe板进行活化处理，再将上述离心管中的溶液转移100-400ul至spe板，依次用100-300ul含有5-100mmol/l乙酸铵水溶液、100-300ul乙腈或甲醇或异丙醇进行清洗，然后加入40-100μl含有0.1％-10％甲酸乙腈作为洗脱液进行洗脱，将洗脱液氮气室温条件下吹干，用40-100μl流动相a进行复溶，得到的液体即为待测样品；(四)待测样品上机检测(e)采用梯度洗脱反相色谱法对分析物进行分离，色谱柱为pfp柱，粒径为1.7-5μm，内径为2.1-4.6mm，柱长为25-250mm，流速为0.2-1ml/min，柱温为25-45℃。

流动相a为水溶液，流动相b为乙腈溶液，二者均含有0.1％-1％有机酸，其中有机酸为甲酸、乙酸中的一种或者一种以上，a相:b相体积比为95％-5％:5％-80％，流速为0.2-1ml/min(见表2)。质谱检测采用电喷雾离子源(esi)和多反应监测模式(mrm)，各分析物检测离子对分别为：mn,180.1>148.3；mn-d3,183.1>151.1；nmn,166.1>134.1；nmn-d3,169.1>137.1；3-mt,151.1>91.1；3-mt-d4,155.1>95.1；e,166.1>135.1；e-d6,172.1>112.1；ne,152.1>107.1；ne-d6,158.1>111.3；da,137.1>91.1；da-d4,141.1>95.1。离子源参数条件见表4，分析物质谱参数见表5。基于上述的实验条件，本发明的回收率在90-110％，精密度

技术特征：

1.一种液相色谱质谱联用法定量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法，其主要步骤为：

1)样本预处理；

2)经预处理的样本溶液进行固相萃取，提取血浆中儿茶酚胺及其代谢物；

3)通过液相色谱质谱联用法特异性检测每种分析物及其内标，将分析物与内标信号的比率与校准曲线的比率进行比较以确定分析物浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，质谱分析采用多反应监测扫描，多反应监测扫描是将第一级质谱设定为用于筛选特定的母离子，在第二级质谱中指定所需的产物；分析物及其内标特异多反应监测扫描离子对在色谱分离过程中被连续监测，仅有在特定多反应监测模式(mrm)在正确分析保留时间被记录时信号才能被定量。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，样本预处理的过程为：

a)血浆样本的离心

取edta抗凝的待检测全血离心得到血浆，将上述血浆于-80℃冷冻下保存至分析前备用；

b)移取含有乙酸铵水溶液配制的内标工作液加入血浆中，涡旋混匀制成复溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，复溶液经过液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测后分别得出甲氧基肾上腺素(mn)、甲氧基去甲肾上腺素(nmn)、3-甲氧基酪胺(3-mt)、肾上腺素(e)、去甲肾上腺素(ne)和多巴胺(da)的色谱图及其对应内标液中的甲氧基肾上腺素-d3、甲氧基去甲肾上腺素-d3、3-甲氧基酪胺-d4、肾上腺素-d6、去甲肾上腺素-d6和多巴胺-d4的色谱图。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，固相萃取血浆中儿茶酚胺和甲氧基肾上腺素类物质的过程为：

移取预处理的血浆样本溶液

a)依次采用含有甲酸的乙腈溶液、乙酸铵水溶液对固相萃取板进行活化；

b)移取预处理的血浆样本溶液至固相萃取板，依次用乙酸铵水溶液、乙腈或甲醇或异丙醇进行清洗，加入含有甲酸的乙腈溶液洗脱，将洗脱液于氮气室温下吹干，用流动相a进行复溶，得到待测样品。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，通过液相色谱质谱联用法特异性检测每种分析物及其内标，将分析物与内标信号的比率与校准曲线的比率进行比较以确定分析物浓度的过程为：

采用梯度洗脱反相色谱法对分析物进行分离，色谱柱为pfp柱，流动相a为水溶液，流动相b为乙腈溶液，二者均含有0.1％-1％有机酸，其中有机酸为甲酸、乙酸中的一种或者一种以上，a相:b相体积比为95％-20％:5％-80％，流速为0.2-1ml/min；

质谱检测采用电喷雾离子源和多反应监测模式，各分析物检测离子对分别为：

mn,180.1>148.3；mn-d3,183.1>151.1；nmn,166.1>134.1；nmn-d3,169.1>137.1；3-mt,151.1>91.1；3-mt-d4,155.1>95.1；e,166.1>135.1；e-d6,172.1>112.1；ne,152.1>107.1；ne-d6,158.1>111.3；da,137.1>91.1；da-d4,141.1>95.1。

技术总结

一种液相色谱质谱联用法定量检测儿茶酚胺及其代谢物的方法，其主要步骤为：1)样本预处理；2)经预处理的样本溶液进行固相萃取，提取血浆中儿茶酚胺及其代谢物；3)通过液相色谱质谱联用法特异性检测每种分析物及其内标，将分析物与内标信号的比率与校准曲线的比率进行比较以确定分析物浓度。本发明可定量检测人血浆样本中6种儿茶酚胺类激素，检测结果可以辅助临床医生用于成年人体内儿茶酚胺类激素含量异常相关疾病的诊断。

技术研发人员：黄颖瑜;王欢红;王建华;袁训娥;吴洪强

受保护的技术使用者：上海百趣生物医学科技有限公司

技术研发日：2019.12.30

技术公布日：2020.04.17