紫外分光光度计及液相色谱仪的原理及使用

1、一、紫外光谱与荧光光谱在产生原理上有何不同?荧光光谱有何特点 ?产生荧光光谱的先决条件是什么? 1、紫外线光谱产生原理 : 紫外- 可见吸收光谱是物质中分子吸收200-800nm光谱区内的光而产生的。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级跃迁 , 当这些电子吸收了外来辐射的能量就从一个能量较低的能级跃迁到一个能量较高的能级。因此 , 每一跃迁都对应着吸收一定的能量辐射。具有不同分子结构的各种物质 , 有对电磁辐射显示选择吸收的特性。吸光光度法就是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收的特性而建立起来的, 它属于分子吸收光谱。跃迁所吸收的能量符合波尔条件。当光照射在物质上时, 其中

2、某些光被选择性地吸收, 当辐射能等于分子中的电子从低能态跃迁到高能态所需能量时, 则分子对光产生吸收 , 即产生了分子吸收光谱。荧光光谱产生的原理 : 物质分子吸收某一波长 ( 激发波长 )辐射能被激发后 , 电子以无辐射方式从高激发态跃迁至第一电子激发态的最低振动能级并释放部分能量,再以辐射的方式释放另一部分能量, 该辐射能 ( 光) 即为荧光 , 其波长为发射波长 , 而产生的光谱即为荧光光谱。2、荧光光谱特点 : (1) 以荧光强度对激发波长作图, 得到激发光谱 ; 同样以荧光强度对发射波长作图得荧光光谱。激发光谱与发射光谱的图形几乎是镜面对称。(2) 基于物质吸收光后仅释放部分能量来发

3、射荧光, 故发射波长大于激发光波长(3) 荧光波长是不变的 , 光谱的形状与激发波长大小无关3、产生荧光光谱的先决条件是: (1) 具有较强的紫外 -可见光吸收(2) 具有一定的荧光效率二、1、在紫外 - 可见光测试中所用的比色杯与荧光测试时用的比色杯有何不同? 在紫外 - 可见光测试中所用的比色杯为两面透光, 荧光测试为四面透光2、玻璃比色杯与石英比色杯各自的适用波长范围?有一个物质的最大吸收为254nm,另一物质的最大吸收为500nm,这两种物质分别可选用哪几种比色杯? 玻璃:320nm以上石英 : 210nm 第二种物质两种比色杯都可以用, 第一种物质则只能用石英比色杯。3、如何清洗比色

4、杯 ? 使用后用所装的溶剂冲洗, 里外都要洗。若溶剂无毒 , 可装入一半 , 用手按住杯两端摇晃, 清洗不少于三次。之后在用大量自来水冲洗。这一步对水溶液和盐溶液非常重要, 若溶剂不亲水, 该步可放弃。可以用去离子水清洗 , 里外都要洗。若溶剂不亲水, 该步可放弃。洗完后不要刻意将比色杯擦干, 虚放在比色杯盒内 , 让其自然挥干。标准是比色杯透明 , 无水渍。若被严重污染 , 可用稀盐酸或厂家提供洗剂清洗。注意事项 : 勿用超生波清洗 (若确实需要 , 应使用专用超声波 , 毛面向下 ), 使用完后立即清洗 , 避免洗液三、简述液相色谱仪在使用过程中主要注意事项与简单维护( 可以从流动相溶剂、

5、色谱柱、进样针与仪器与色谱柱的清洗等方面分别简述) 。(1) 注意事项 : 水相中的水须是超纯水有机相与水相选用相应的0.45 或 0.22 过滤膜过滤并脱气。每两天更换或过滤溶剂, 避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。经常清洗贮液瓶 , 避免直接日照 ; 四氢呋喃及醚类溶剂、水、缓冲液放在棕色瓶中为宜 , 以防光照变质 , 及长菌。经常清洗过滤头。样品的检测波长至少大于溶剂的截止波长20nm;用流动相或比其弱的溶剂解样品 ; 在不影响分析条件的情况下, 进样量尽可能要小。色谱柱 : 对新的柱子要测试一下它的性能, 并记录下它的各个参数及测试条件, 不使用时保存在适当的溶剂中如甲醛等, 注意柱子的

6、 ph适用范围 , 不要在高温下清洗或高温下长时间使用柱子, 分析样品时注意柱子的正反, 不能反冲柱子。样品 : 样品通常进行前处理后用0.45 或 0.22 单位的微孔滤膜过滤。(2) 简单维护 : 保证仪器、储液瓶、输液管路的清洁。保证溶剂的相溶性用 0.45 或 0.22u 滤膜过滤流动相、脱气。经常检查进样针 , 定期清洗或更换进样针 , 以确保进样的准确性用 0.45 或 0.22u 滤器过滤样品。仪器使用完毕 , 用有机相冲洗整个系统。如流动相中含有酸、碱或盐类, 需先用 5% 或与流动相相同比例的水与有机溶剂冲洗整个系统至少30 至 45分钟, 然后再用有机相冲洗整个系统15 分

7、钟左右 , 以确保色谱柱与防止系统损坏。定期清洗整个系统 , 检测各种性能 , 并做好维护保养工作。四、气象色谱仪由哪几部分组成, 气象色谱柱在何时需要老化, 如何老化及注意点? (1) 结构: 气路系统进样系统分离系统检测系统记录系统(2) 何时需要老化 : 新的未使用过的色谱柱经从仪器上拆卸下来 , 在下一次使用之前色谱图分离不佳 , 出现异常 (在排除其他情况下 ) (3) 老化步骤 : 通常在室温下先通载气, 以赶走柱内的空气以较低的初始温度缓慢程序升温至最高使用温度, 持续一段时间 , 老化色谱柱 2-3 次, 或在较高的温度下老化更长的时间( 低于柱最高温度 , 或过夜。 ) (4

8、) 注意事项 : 载气的流速不易过大温度低于柱的最高温度不能用氢气做载气 , 以防爆炸不能同时与检测器相连五、大型仪器优良的实验操作包括哪几点? 保持实验室整洁与清洁包括清洁的仪器、导管、容器、量器、样品、流动相等。选择符合要求的溶剂、试剂、气体、比色杯及注意溶剂的相容性。初次使用仪器 , 须在专职老师指导下进行操作, 经老师认可后 , 放能独立进行操作。严格按照标准操作规程sop, 进行仪器操作 , 不经允许不得拆卸仪器的相关部件。使用完毕后 , 关闭仪器、电源、保持实验室清洁及注意安全。做仪器使用记录包括所使用的开机、关机时间、使用时数、使用的溶剂( 流动相) 、以及使用时仪器的状况 ( 正常或出现异常的情况、故障等), 使用人签名。