维生素A、E标准溶液浓度校正和核查方法、色谱图.pdf

GB xxxx—xxxx附录A维生素A 、E 标准溶液浓度校正和核查方法 A.1 维生素A 标准溶液浓度校正和核查方法。 A.1.1 维生素A 标准溶液的浓度校正 A.1.1.1 准确吸取全反式视黄醇标准储备溶液（1.00 mg/mL）50 µL 于25 mL 的棕色容量瓶中，用无 水乙醇定容至刻度，混匀，用1 cm 石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按表A.1.1 的波长测定其吸 光度，并按附录A.3.2色谱条件测定色谱纯度（面积归一化法）。 A.1.1.2 准确吸取13-顺式视黄醇标准储备溶液（0.100 mg/mL ）200 µL 于10 mL 的棕色容量瓶中，用 无水乙醇定容至刻度，混匀，用1 cm 石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按表A.1.1 的波长测定其 吸光度，并按附录A.3.2色谱条件测定色谱纯度（面积归一化法）。 A.1.1.3 准确吸取取视黄醇棕榈酸酯标准储备溶液（1.00 mg/mL）50 µL 于25 mL 的棕色容量瓶中， 用无水乙醇定容至刻度，混匀，用1 cm 石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按表A.1.1 的波长测定 其吸光度，并按附录A.3.1色谱条件测定色谱纯度（面积归一化法）。

A.1.1.4 准确吸取视黄醇乙酸酯标准储备溶液（1.00 mg/mL）50 µL 于25 mL 的棕色容量瓶中，用无 水乙醇定容至刻度，混匀，用1 cm 石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按表A.1.1 的波长测定其吸 光度，并按附录A.3.2色谱条件测定色谱纯度（面积归一化法）。表A.1.1 维生素A 标准溶液测定波长及百分吸光系数目标物波长nmE全反式视黄醇325183013-顺式视黄醇3281686视黄醇棕榈酸酯325975视黄醇乙酸酯3251560维生素A 的浓度按式A.1 计算：4A  10X  P……………………………………… （A.1 ）E式中： X—维生素A 的标准液浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；A—维生素A 的标准液的平均紫外吸光值；E—维生素A 的1%比色光系数；P—色谱纯度。 A.1.2 全反式视黄醇标准储备溶液的核查准确吸取全反式视黄醇标准储备溶液 （1.00 mg/mL）50 µL 于25 mL 的棕色容量瓶中，用无水乙 醇定容至刻度，混匀，用1 cm 石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按表A.1.2 的波长测定其吸光度， 并计算各波长下的吸光度比值，若各比值全部满足表A.1.2 的要求，可继续使用，否则应重新配制。

1GB xxxx—xxxx表A.1.2 全反式视黄醇标准储备液核查波长比值要求吸光度比值A300nm/A325nmA350nm/A325nmA370nm/A325nm比值规定≤ 0.602≤ 0.452≤ 0.093 A.2 维生素E 标准溶液浓度校正和核查方法。 A.2.1 分别准确移取α-生育酚乙酸酯（5.00 mg/mL）100 µL，α-生育酚（1.00 mg/mL）、d-β-生育酚 （1.00 mg/mL）、d-γ-生育酚（1.00 mg/mL）、d-δ-生育酚（1.00 mg/mL）、d-α-生育三烯酚（1.00 mg/mL） 标准储备溶液500 µL 于各10 mL 棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀，分别用 1 cm 石英比 色杯，以无水乙醇为空白参比，按表A.2 的测定波长测定其吸光度，并按附录A.3.2色谱条件测定色 谱纯度（面积归一化法）。维生素E 的浓度按式A.2 ：4A  10X  PE……………………………………… （A.2 ）式中： X—维生素E 的标准液浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；A—维生素E 的标准液的平均紫外吸光值；E—维生素E 的1%比色光系数；P—色谱纯度。

表A.2 维生素E 标准溶液测定波长及百分吸光系数目标物波长nmEα-生育酚乙酸酯28443.6α-生育酚29276d-β-生育酚29689d-γ-生育酚29891d-δ-生育酚29887d-α-生育三烯酚29286 A.2.2 α-生育酚标准储备溶液的核查分别测定α-生育酚在292 nm、255 nm 波长下的吸光度，两个波长下的吸光度比值A255/A292 小 于等于0.18 时，可继续使用，否则应重新配制。 A.3 维生素A 或E 的色谱纯度测定 A.3.1 试样溶液制备2GB xxxx—xxxx同A.1 和A..2 A.3.2色谱条件 A.3.2.1 全反式视黄醇、13-顺式视黄醇纯度测定色谱条件 A.3.2.1.1 色谱柱：C30 柱，柱长150 mm ，内径4.6 mm，粒径3 µm，或相当者。 A.3.2.1.2 柱 温：25 ˚C A.3.2.1.3 流动相：A 相，水；B 相，甲醇，83%A ；等度洗脱，总运行时间30 min 。 A.3.2.1.4 流动相流速：0.8 mL/min 。 A.3.2.1.5 检测波长：325 nm A.3.2.1.6 进样量：20 μL 。

A.3.2.2 全反式视黄醇棕榈酸酯、全反式视黄醇乙酸酯、α-生育酚乙酸酯、α-生育酚、d-β-生育酚、d-γ- 生育酚、d-δ-生育酚、d-α-生育三烯酚纯度测定色谱条件 A.3.2.2.1 色谱柱： C30 柱，柱长150 mm ，内径4.6 mm，粒径3 µm，或相当者。。 A.3.2.2.2 柱 温：25 ˚C A.3.2.2.3 流动相：甲醇，总运行时间30 min 。 A.3.2.2.4 流动相流速：0.8 mL/min 。 A.3.2.2.5 检测波长：见表A.1.1 和表A.2 。 A.3.2.2.6 进样量：20 μL 。 A.3.3计算方法以无水乙醇为空白参比，用面积归一化法计算主峰面积占扣除空白试剂峰后的所有峰面积之和的 百分比。 A.3.4标准溶液纯度色谱图全反式视黄醇、13-顺式视黄醇、全反式视黄醇棕榈酸酯、全反式视黄醇乙酸酯、α-生育酚乙酸酯、 α-生育酚、d-β-生育酚、d-γ-生育酚、d-δ-生育酚、d-α-生育三烯酚标准溶液纯度测定色谱图见图A.1～ 图A. 10。0.30318.710.20UA0.10100.710.000.005.0010.0015.0020.0025.0030.00Minutes图A.1全反式视黄醇标准溶液（2 µg/L）的纯度测定色谱图3GB xxxx—xxxx0.30791.70.201 U A0.10005975356...17910.000.05.010.015.020.025.030.0Minutes图A.213-顺式视黄醇标准溶液（50 µg/L）的纯度测定色谱图0.20926.0.153 U 0.10 A0.05922.30.000.005.0010.0015.0020.0025.0030.00Minutes图A.3全反式视黄醇乙酸酯标准溶液（2 µg/L）的纯度测定色谱图0.02050.01535.62 U 0.010 A0.005854.320.0000.005.0010.0015.0020.0025.0030.00Minutes图A.4全反式视黄醇棕榈酸酯标准溶液（2 µg/L）的纯度测定色谱图4GB xxxx—xxxx0.0850.0683.90.04 U A0.020.000.005.0010.0015.0020.0025.0030.00Minutes图A.5 α-生育酚乙酸酯标准溶液（50 µg/L）的纯度测定色谱图0.0500.04080.03004.53 U A0.0200.0100.0000.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00Minutes图A.6 α-生育酚标准溶液（50 µg/L）的纯度测定色谱图0.0500.0402790.030.23 U A0.0200.0100.0000.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00Minutes图A.7d-β-生育酚标准溶液（50 µg/L）的纯度测定色谱图5GB xxxx—xxxx0.0500.04060.03030.2 U3 A0.0200.010358.230.0000.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00Minutes图A.8d-γ-生育酚标准溶液（50 µg/L）的纯度测定色谱图0.0500.0400.030275. U8 A20.0200.010348.10.00030.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00Minutes图A.9d-δ-生育酚标准溶液（50 µg/L）的纯度测定色谱图0.0500.040369.0.03052 U A0.0200.010333.520.0000.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00Minutes图A.10d-α-生育三烯酚标准溶液（50 µg/L）的纯度测定色谱图6GB xxxx—xxxx附录B维生素A 和E 液相色谱图维生素A 和E 反相高效液相色谱图见图B.1.1、图B.1.2 和图B.1.3 说明：1，13-顺式视黄醇；2 ，全反式视黄醇图B.1.1 维生素A 标准溶液 （1μg/mL）的反相高效液相色谱图 （紫外检测，波长325 nm ） 说明：1， α-三烯生育酚；2 ，d-δ-生育酚；3，d-γ-生育酚；4 ，d-β-生育酚；5，α-生育酚。

图B.1.2 维生素E 标准溶液（5 μg/mL）的反相高效液相色谱图（荧光检测: 激发波长294 nm ，发射波长328 nm） 说明：1， α-三烯生育酚；2 ，d-δ-生育酚；3，d-γ-生育酚；4 ，d-β-生育酚；5，α-生育酚。图B.1.3 50 μg/mL 维生素E 标准溶液的反相高效液相色谱图 （紫外检测，波长294 nm ）7GB xxxx—xxxx维生素A 和E 正相高效液相色谱图见图B.2.1、B.2.2 和B.2.3 说明：1，13-顺式视黄醇棕榈酸酯；2 ，全反式视黄醇棕榈酸酯；3，全反式视黄醇乙酸酯图B.2.1 维生素A 标准溶液 （1 μg/mL）的正相高效液相色谱图（紫外检测，波长325 nm ） 说明：1， α-生育酚乙酸酯；2，α-生育酚；3，α-三烯生育酚；4 ，d-β-生育酚；5，d-γ-生育酚；6，d-δ-生育酚。图B.2.2 维生素E 标准溶液（5 μg/mL）的正相高效液相色谱图（荧光检测: 激发波长294 nm ，发射波长328 nm） 说明：1， α-生育酚乙酸酯；2，α-生育酚；3，α-三烯生育酚；4 ，d-β-生育酚；5，d-γ-生育酚；6，d-δ-生育酚。

图B.2.3 维生素E 标准溶液（5 μg/mL）的正相高效液相色谱图（荧光检测: 激发波长280 nm ，发射波长为310 nm）8GB xxxx—xxxx d-α-生育酚与dl-α-生育酚的手性柱反相高效液相色谱法色谱图见图B.3.1和B.3.2 说明：1，d-α-生育酚图B.3.1 d-α-生育酚标准溶液（5 μg/mL）的反相高效液相色谱图（荧光检测: 激发波长294 nm ，发射波长328 nm） 说明：1，dl-α-生育酚组分峰 1；2 ，dl-α-生育酚组分峰2图B.3.2 dl-α-生育酚标准溶液（10 μg/mL）的反相高效液相色谱图（荧光检测: 激发波长294 nm ，发射波长328 nm）9